酶联免疫吸附实验实验操作（二）

1：再每个EP管中加入150ul标准品稀释液，更换枪头后在1号管中加入150ul标准品。更换枪头并将EP管用混匀仪混匀5秒

2：在1号管中吸取150ul加入2号管中，更换枪头并将EP管用混匀仪混匀5秒。在2管中吸取150ul加入到3号管中，以此类推

3：【加样】：移液器调至50ul，标准品每个浓度点2个孔，每孔加入50ul。（加样过程中注意更换枪头)多道移液器调至40ul，样本孔中每孔加入40ul样本稀释液；更换10ul移液器和枪头，样本孔中每孔加入10ul样本（空白孔中不加入任何液体）（上海轩泽康生物温馨提示：加样时间尽量控制在15分钟之内完成，避免造成前后孔反应时差。）

4：【孵育及洗涤）：封上封板膜并轻轻摇晃酶标板，标记项目及时间后置入37℃恒温箱中孵育30分钟。孵育结束后取出酶标板。

5：【洗涤】：将洗涤液倒入容器中，小心揭掉封板膜。弃去液体并在吸水纸上拍干。准备200ul多道移液器，每孔加200ul洗涤液，静置30秒后弃去液体。重复洗涤、静置、弃液步骤5次并拍干酶标板。

6：【加酶】：每孔加入酶标试剂50ul（空白孔除外），封上封板膜并轻轻摇晃酶标板，标记项目及时间后置入37℃恒温箱中孵育30分钟，孵育结束后取出酶标板。小心揭掉封板膜，弃去液体。

7：【洗涤】：每孔加200ul洗涤液，静置30秒后弃去。重复洗涤、静置、弃液步骤5次。在吸水纸上拍干剩余液体。

8：【显色】：将底物A、B分别倒入容器中.每孔加入50ul底物A,更换枪头后每孔加入50ul底物B。封上封板膜并轻轻摇晃酶标板，标记项目及时间后置入37℃恒温箱中避光孵育10分钟.孵育结束后取出酶标板。小心揭掉封板膜。

此时酶标板应有成梯度的可见色差

9：【终止】：终止液倒入容器中，每孔加终止液50ul进行终止反应。此时酶标板内液体由蓝色转变为黄色，轻轻摇晃酶标板后待用。

10：【测定读数】：酶标板放入酶标仪进行检测，以空白孔调零450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）

测定应在加终止液后15分钟以内进行。