IHC（免疫组化）融合了免疫学原理（抗原抗体特异性结合）和组织学技术（组织的取材、固定、包埋、切片、脱蜡、水化等），通过化学反应使标记抗体的显色剂 （荧光素、酶、金属离子、同位素）显色，来对组织（细胞）内抗原进行定位、定性及定量的研究（主要是定位）。IHC 实验注意事项：

1. 组织取材

为避免蛋白丢失及组织受损引起的非特异试剂吸附，取材须快速（组织块也不宜太大）且要尽量避免人为损伤。

2. 固定

固定要及时、，但也不能固定过久。实验证明甲醛固定时间越久的组织越容易出现自发荧光及非特异性染色。一般以 12~36 小时*。

3. 石蜡片与冰冻片的选择

石蜡片制作对设备要求较冰冻片低，组织结构更好，保存条件简单时间也久。但对部分蛋白有较强烈的破坏作用，对蛋白保护较冰冻片差。冰冻片对蛋白的保护较石蜡片好，制作起来也较快。

4. 灭活

过氧化物酶（HRP）系统的一定要做内源性过氧化物酶的灭活，而对于碱性磷酸酶（AP）系统和免疫荧光这个步骤不需要做。

5. 抗原修复

不同的样本、不同的蛋白其*的抗原修复方式会有所区别，热修复（酸性修复液（柠檬酸盐修复液）、碱性修复液（EDTA 修复液）及酶修复（蛋白酶）都可做尝试。对于陈旧的样本要增加修复强度，比如延长修复时间。

6. 封闭

常用的封闭液有 5% BSA 和血清。BSA 是通用型的封闭液。血清应选择与二抗同源的血清。

7. 抗体孵育

一抗一定要与实验及样本匹配的，孵育条件以 4 ℃ **。二抗应匹配一抗，37 ℃ 孵育半小时即可。

8. 显色

DAB 显色建议在镜下控制反应时间，在阳性及背景之间选择平衡点。

9. 结果观察

建议在数据库中查询准确的表达部位。