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大视场双光子显微成像系统的应用与发展

发布时间:2024/09/11 13:44:15 发布厂商:武汉光量科技有限公司 >> 进入该公司展台

双光子显微成像具备高分辨率、天然层析能力和大穿透深度等特点,在活体动物成像中发挥着重要作用。然而,如何在维持高分辨率的条件下,扩大双光子的成像视场,来满足生物医学中对大规模动态反应的监测需求,一直以来都是光学显微成像领域的难点,也是科研关注的重点。

 

香港理工大学姚靖、余志鹏团队在《红外与激光工程》发表文章,综述了大视场双光子成像技术的研究进展。介绍了双光子显微成像系统的产生背景和设计原理,并从光学不变量的角度阐述了实现大视场双光子成像的理论基础,并重点回顾了现有的几种大视场双光子成像方法。

 

大视场双光子显微成像系统的应用与发展

 

基于双光子成像的高时间和空间分辨特性,大视场双光子成像技术将成为一种在脑科学等需介观高分辨成像领域的应用中实现大区域动态监测的强有力的工具。

 

大视场双光子成像的理论基础

 

实现大视场、高分辨率的双光子成像的难度在于保证分辨率的同时增加成像视场。成像物镜的数值孔径决定了系统成像的衍射极限分辨率,而物镜放大倍数和视场数决定了成像系统的*成像视场。

 

另外,在双光子系统中,可用一个光学量来同时衡量各光学元件(系统)的衍射极限分辨率和视场大小,人们称之为光学不变量,光学不变量可同时衡量光学元件的衍射极限分辨率和视场大小。对于大视场双光子成像系统,需要挑选或特殊设计具有大光学不变量的元件。

 

大视场双光子显微成像系统的应用与发展

图1.光学不变量的定义。(a)物镜的光学不变量;(b)扫描中继的光学不变量;(c)荧光收集系统的光学不变量

 

大视场双光子显微成像系统的应用与发展

图2.通过光学不变量设计大视场双光子成像系统。(a)成像系统图;(b) 小鼠皮层的大视场双光子脑血管成像

 

具体来说,在设计大视场双光子成像系统时,可将其大致分为三部分进行分块设计优化,分别为成像物镜、扫描中继系统与荧光收集系统。在设计时,应选择低放大倍数的成像物镜,并对比其光学不变量;扫描中继系统应减少大角度扫描时产生的离轴像差;荧光收集系统的光学不变量也应等于或大于选定物镜的光学不变量。

 

大视场双光子成像与其应用

 

扫描中继系统的边缘像差校准

双光子成像系统属于激光点扫描式显微镜的一种,要实现大视场双光子成像,必须进行大角度扫描以增加实际光学不变量。然而,大角度扫描过程中由扫描系统引起的像差会对整个系统的成像性能造成较大影响。

 

2015年,Philbert S.Tsai等提出了一种使用大孔径的多透镜组合的方法,减小了扫描系统引起的像差,实现接近于衍射极限的高分辨率大视场双光子成像。

 

大视场双光子显微成像系统的应用与发展

图3.透镜组优化大视场扫描离轴像差实现大视场双光子成像系统。(a)成像系统图;(b)视场边缘位置和中心位置的点扩散函数,由0.5µm荧光小球测得;(c)开双颅的清醒、头部固定的小鼠左右脑半球的大视场双光子小动脉血管成像(波长800nm,*强度投影)

 

该方法主要是从传统光学设计角度以及光学像差的光学补偿角度优化大视场成像系统,通过补偿大视场扫描引起的大离轴像差,*终在近衍射极限的分辨率下监测到了不同脑区的血管以及神经活动。

 

高通量物镜的设计研发

成像物镜的光学不变量限制了整个双光子成像系统的光学不变量,也限制了*终的成像视场与分辨率。所以无论对物镜前的光路进行多复杂的特殊设计,*终影响整个大视场双光子系统的关键元件仍然是物镜。目前市面上支持大光学不变量的商业物镜有限,同时这些商业物镜支持的*视场也有限。因此,要实现更大视场的高分辨双光子成像,使用高通量的自制成像物镜是将成像视场进一步拓展的关键

 

2016年,Nicholas James Sofroniew等设计的用于大视场成像的双光子随机扫描显微镜(2-p RAM),其*可实现成像视场为5mm×5mm,并具有亚细胞级别的近衍射极限的分辨率。该系统使用设计的高性能、大光学不变量成像物镜实现大视场高分辨双光子成像。*终他们通过该系统对麻醉的转基因小鼠实现了大视场的神经活动分析。

 

大视场双光子显微成像系统的应用与发展

图4.大视场双光子随机扫描显微系统。(a)成像系统图;(b)视场边缘位置和中心位置的点扩散函数,由0.5µm荧光小球测得;(c)大视场成像麻醉thy-1小鼠荧光蛋白(*强度投影)和虚线区域的细节图

 

同年,Jeffrey N Stirman等设计了一款大视场的双光子显微镜,用于快速的同时扫描多区域分散的神经细胞元群体。该大视场双光子系统同样基于自制大通量成像物镜进行设计。该成像物镜具有大的光学不变量,即具有较低放大倍数的同时具有较高的数值孔径,从而可以实现大视场成像的高分辨成像。

 

大视场双光子显微成像系统的应用与发展

图5.大视场多区域双光子扫描显微镜。(a)成像系统图;(b)视场边缘位置和中心位置的点扩散函数,由0.5µm荧光小球测得;(c)大视场成像检测转基因小鼠的神经元活动,该小鼠表达GCaMP6 s钙离子荧光指示剂。(d)分割上图产生的5361个活动神经元;(e)同时的双区域神经成像

 

该大视场成像系统的主要亮点在于同时的跨多区域成像。*终他们通过该大视场多区域系统测量了小鼠视觉处理过程中两个皮层视觉区域之间的活动相关性。

 

的来说,在活体生物成像中,大视场扫描的同时不可避免的会降低成像的速度,这会造成对生物组织的光漂白和光毒性增加,同时也会造成荧光信号的衰减。所以快速大视场扫描和同时多区域扫描是两种可将大视场双光子显微镜拓展至生物医学应用领域的有效思路。

 

自适应光学方法的使用

通常情况下,商业成像物镜都会有一个厂商的*成像视场区域。在该区域内,物镜厂商通过光学设计尽可能的对像差进行优化。而过该视场时,像差会急剧的增加。

 

2022年,Yao等提出一种更通用的大视场双光子方法。该系统*终成像视场直径为3.46mm,轴向分辨率为0.84μm,轴向分辨率为5.8μm。在不改变系统复杂度和无需复杂设计的前提下,该技术通过自适应光学实现了大视场、高分辨和高信噪比的双光子成像。

 

大视场双光子显微成像系统的应用与发展

图6.使用自适应光学提高双光子成像视场。(a)原理图;(b)成像光路图;(c)thy-1小鼠脑片的大视场成像图(*强度投影);(d)图(c)左下角标示位置荧光信号通过自适应光学技术的提升

 

该策略通过自适应光学技术来补偿过视场扫描过程中成像物镜产生的大离轴像差。该技术具有较好的通用性,一方面不仅适用于普通的大视场双光子成像系统,对于传统的含高倍数物镜的小视场双光子显微镜,也可在光路前加入波前矫正元件来拓展其*视场。另一方面,可以将该技术拓展到任何激光扫描显微成像领域,通过像差补偿元件的加入*增加成像系统的可用视场。

 

大视场双光子脑成像的应用优势

通过各类方法提高双光子成像系统的成像视场,能在保证其高分辨率的情况下,增大可探测区域。具体来说,相比于传统的双光子成像,大视场双光子成像系统可将成像视场直径拓展至5-10倍,即在保证亚细胞级别分辨率的情况下将探测区域*拓展100倍左右。目前,双光子用于小鼠脑成像主要有两个方向:脑内血管成像和脑内神经元或钙离子成像。

 

大视场双光子脑内血管成像能够分辨全脑或多脑区小鼠脑内血管状态,为肿瘤分析、缺血或败血模型等病理应用提供一种有效的工具。在小鼠脑内神经元或钙离子成像中,支持感觉编码和运动输出的神经元活动分布在新皮质的多个区域。从大视场双光子神经元或钙离子成像结果中可以看出,大视场双光子成像系统可以同时跨多个皮层区域成像,从而获得扩展皮质网络的细胞分辨率视图,这对多皮层协调的神经活动或系统的阐明神经编码的原理至关重要。

 

结与展望

 

大视场双光子成像是双光子成像领域的新方向,虽然已有多种大视场成像技术,但在实际应用中仍面临设计难度和成本等问题。

 

未来,需要一种更通用、更具的方式来解除成像视场的限制。此外,将大视场成像技术与其他领域技术相结合,如贝塞尔扫描技术光透明技术光学波前整形技术等,将是大视场双光子成像的发展方向,有望实现大视场大深度的双光子成像。

 

声明:本文仅用作学术目的。文章来源于:姚靖,余志鹏,高玉峰,叶世蔚,郑炜,赖溥祥.大视场双光子显微成像系统研究进展(特邀)[J].红外与激光工程,2022,51(11):20220550.Jing Yao,Zhipeng Yu,Yufeng Gao,Shiwei Ye,Wei Zheng,Puxiang Lai.Advances of large field-of-view two-photon microscopy system (invited)[J].Infrared and Laser Engineering,2022,51(11):20220550.

 

大视场双光子显微成像系统的应用与发展

 

双光子显微成像系统
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